Fermentai (lot. fermentum - rūgimas), tai specifiniai baltymai, kurių turi visos gyvosios ląstelės. Jie atlieka biologinių katalizatorių vaidmenį. Fermentų pagalba yra realizuojama genetinė informacija ir vykdoma medžiagų ir energijos apykaita gyvuosiuose organizmuose.
Viena fermentų ypatybių - tai sugebėjimas reguliuojamai ir kryptingai veikti. Jo sąskaita yra kontroliuojama visa medžiagų apykaitos grandžių darna. Šį sugebėjimą nulemia fermentų struktūrinės molekulės erdviškumas.
Fermentų struktūra ir savybės
Fermentai gali būti paprastieji ir sudėtiniai, kurių sudėtyje, be baltyminio komponento (apofermento) yra dar ir nebaltyminė dalis - kofermentas. Fermentų veikimo efektyvumą lemia žymus katalizuojamos reakcijos energijos aktivacijos sumažėjimas tarpinių fermentų-substratinių kompleksų susidarymo rezultate.
Substratų prisijungimas vyksta aktyviuosiuose centruose, kurie yra panašūs tik į tam tikrus substratus, kuo pasiekiama išskirtinė fermentų veikimo specifika. Kai kurie fermentai, be aktyviųjų centrų, turi ir papildomų, taip vadinamų alosterinių reguliuojančių centrų.
Fermentų biosintezę kontroliuoja genai. Skiriami konstitutyviniai (pastoviai esantys ląstelėse) ir indukuojami fermentai, kurių biosintezė aktyvuojasi veikiant atitinkamiems substratams. Kai kurie funkcionaliai tarpusavyje susiję fermentai ląstelėje sudaro struktūriškai organizuotus polifermentinius kompleksus.
Dauguma fermentų ir fermentinių kompleksų yra glaudžiai susiję su ląstelės membranomis ir jos organoidais (mitochondrijomis, lizosomomis, mikrosomomis ir t.t.) ir dalyvauja aktyviame medžiagų transportavime per membranas.
Žinoma daugiau kaip 20000 įvairiausių fermentų, daugelis kurių yra išskirti iš gyvųjų ląstelių ir gauti natūralioje būklėje. Pirmąjį kristalinį fermentą (ureazę) išskyrė amerikiečių biochemikas D.Samneris 1926 metais. Kai kurių fermentų yra išanalizuota aminorūgščių seka, išaiškintas polipeptidų grandinių išsidėstymas trimatėje erdvėje. Laboratorijos sąlygomis įvykdytas dirbtinė cheminė ribonukleazės fermento sintezė.
Fermentai naudojami įvairių medžiagų kiekiniam nustatymui ar išgavimui, nukleino rūgšties molekulių modifikacijai genų inžinierijos metodais, eilės susirgimų diagnostikai ir gydymui, taip pat eilėje technologinių procesų, vykdomų lengvojoje, maisto ir farmacijos pramonėje.
Kadangi fermentai yra baltymai, jie turi visas jiems būdingas savybes. Tuo pačiu biokatalizatoriai charakterizuojami eile specifinių savybių, esančių taip pat baltyminės prigimties. Šios savybės skiria fermentus nuo paprasto katalizatoriaus.
Fermentų termolabilumas paaiškinamas tuo, kad temperatūra veikia fermento baltyminę dalį, kas, esant aukštai temperatūrai lemia baltymo denatūraciją ir katalitinės funkcijos sumažėjimą, bet kita vertus lemia fermentų-substratų komplekso susidarymo reakcijos greitį ir visus sekančius substrato kitimo etapus, kas lemia katalizės sustiprėjimą. Fermento katalitinio aktyvumo priklausomybė nuo temperatūros išreiškiama tipine kreive.
Iki tam tikros atžymos (vidutiniškai iki 50°C) katalitinis aktyvumas auga, kas 10°C apytikriai 2 kartus išauga substrato kitimo greitis. Tuo tarpu palaipsniui auga inaktyvuoto fermento kiekis, jo baltyminės dalies denatūracijos sąskaita. Esant virš 50°C temperatūrai smarkiai padidėja fermentinio baltymo denatūracija, ir, nors substrato kitimų reakcijų graitis kylia, fermento aktyvumas, išreikštas pakitusio substrato kiekiu, krenta.
Temperatūra, prie kurios fermento katalitinis aktyvumas yra maksimalus, vadinama temperatūriniu optimumu. Skirtingų fermentų temperatūrinis optimumas yra nevienodas. Gyvulinės kilmės fermentų jis yra 40°-50°C, tačiau egzistuoja ir turintys aukštesnį temperatūrinį optimumą, pvz.
Fermento priklausomybė nuo pH terpės reikšmės buvo nustatyta daugiau kaip prieš 50 metų. Kiek vienas fermentas turi savo optimalų pH, prie kurio pasireiškia jo maksimalus aktyvumas. Daugumos fermentų maksimalus aktyvumas pastebimas pH zonoje netoli neutralaus taško. Labai rūgščioje ar šarminėje terpėje gerai veikia tik kai kurie fermentai.
Perėjimas prie didesnės ar mažesnės (palyginus su optimalia) vandenilinių jonų koncentracijos sukelia fermento aktyvumo kritimą. Vandenilinių jonų koncentracijos įtaka katalitiniam fermentų aktyvumui pasireiškia jo aktyvaus centro poveikiu. Prie skirtingų pH reikšmių reakcinėje terpėje aktyvusis centras gali būti stipriau ar silpniau jonizuotas, daugiau ar mažiau priklausomas nuo kamyninių polipeptidų grandinės fermentų baltyminių dalių ir t.t.
Terpės pH įtakoja substrato, fermentų-substratų komplekso, reakcijos produktų jonizacijos laipsnį, įtakoja fermento būseną, nustatant jame katijoninių ir anijoninių centrų sąveiką, kas veikia baltyminės molekulės struktūrą.
Specifiškumas - viena ypatingų fermentų savybių. Ši savybė buvo atrasta dar 19 a., kai buvo pastebėta, kad labai artimos struktūros substancijos - erdviniai izomerai (α- ir β-metilgliukozidai) yra skaidomi dviem visiškai skirtingais fermentais. Tokiu būdu fermentai gali atskirti cheminius junginius, besiskiriančius vieni nuo kitų nereikšmingomis struktūrinėmis detalėmis, pvz. 1894 m.
50-taisiais 20 a. metais šis statiškas įsitikinimas buvo pakeistas D.Košlando hipoteze apie indukuoto substrato ir fermento atitikimą. Jos esmė yra tame, kad erdvinis substrato ir fermento aktyvaus centro atitikimas susikuria jų tarpusavio sąveikos momentu, kas gali būti išreikšta formule: „pirštinė-ranka”.
Tuo tarpu substrate jau deformuojasi kai kurie valentiniai(1) ryšiai, ir jis ruošiasi tolesniam katalitiniam kitimui, o fermento molekulėje įvyksta konformaciniai persitvarkymai. Košlando hipotezė, paremta aktyvaus fermento centro lankstumo teze, patenkinamai aiškino fermentų veikimo aktyvavimą ir inhibiciją ir jų aktyvumo reguliavimą veikiant įvairiems faktoriams.
Šiuo metu Košlando hipotezė yra išstumiama topocheminio atititkimo hipotezės. Išsaugodama pagrindines Košlando teorijos tezes, ji fiksuoja tai, kad fermentų veikimo specifiką galima paaiškinti visų pirma tos substrato dalies, kuri nesikeičia vykstant katalizei. Tarp šios substrato dalies ir fermento substratinio centro įvyksta įvairios taškinės hidrofobinės sąveikos ir vandeniliniai ryšiai.
Fermentai gali būti vienakomponenčiais, paprastaisiais baltymais ir dvikomponenčiais, sudėtingaisiais baltymais. Antruoju atveju randame papildoma nebaltyminės kilmės grupę. Skirtingu metu atsirado įvairūs baltymų dalies ir papildomos grupės dvikomponenčiuose fermentuose pavadinimai.
Svarbiausių kofermentų cheminė prigimtis buvo išaiškinta 30-taisiais 20 amžiaus metais O.Varburgo, R.Kuno, P.Karero ir kt. darbuose. Dvikomponenčiams fermentams yra būdinga tai, kad nei jų baltyminė dali, nei papildoma grupė neturi pastebimo katalitinio aktyvumo, o tik jų kompleksas pasireiškia fermantacinėmis savybėmis.
Tačiau baltymas smarkiai padidina papildomos grupės katalitinį aktyvumą, kuris laisvame stovyje jai nėra būdingas. Papildoma grupė stabilizuoja baltyminę dalį ir daro ją atsparesne denaturuojantiems agentams.
Tokiu būdu, nors katalitinės funkcijos atlikėjas yra prostetinė grupė, sudaranti katalitinį centrą, jos veikimas neįmanomas be fermento baltyminės dalies polipeptidinių fragmentų dalyvavimo. Apofermentas turi dalį, vadinama specifine struktūra, rinktinai surišančia kofermentą. Tai taip vadinamas kofermentą rišantis domenas; jos struktūra, skirtingų apofermentų, besijungiančių su tuo pačiu kofermentu, tarpe yra labai panaši.
Pvz. tokios yra erdvinės nuokleotidų rišamųjų domenų iš dehidrogenazių eilės struktūros. Kitaip yra su vienkomponenčiais fermentais, kurie neturi papildomos grupės, kuri galėtų betarpiškai kontaktuoti su keičiamu junginiu. Šią funkciją atlieka baltyminės molekulės dalis, vadinama katalitiniu centru.
Aminorūgštiniai likučiai, sudarantys katalitinį centrą vienakomponenčiame fermente, išdėstyti skirtinguose vieningos polipeptidų grandinės taškuose. Todėl katalitinis centras susidaro tuo momentu, kai baltymų molekulė įgauna jai būdingą tretinę struktūrą. Vadinasi, fermento tretinės struktūros pakitimas, veikiant vieniems ar kitiems faktoriams, gali sąlygoti katalitinio centro deformaciją ir fermentatinio aktyvumo pakitimą.
Substratinis centras tai fermento molekulės dalis, atsakanti už substrato, patyrusio fermentinius virsmus, prisijungimą. Dažnai ši dalis vadinama fermento „inkarine aikštele“, kur substratas sustoja kaip laivas išmetęs inkarą. Neverta absoliutizuoti substratinio ir katalitinio centro savokų. Realiai substratinis centras gali sutapti arba persidengti su katalitiniu. Katalitinis gali baigti formuotis substrato prisijungimo metu.
Todėl dažnai kalbama apie fermento aktyvųjį centrą, kuris apjungia savyje abudu. Alosterinis centras - tai fermento molekulės dalis, prie kurios prisijungus substratui turinčiam mažai ar daug molekulių, pasikeičia baltymo molekulės tretinė struktūra. Ko pasekoje kinta aktyvaus centro konfigūracija, kas sukelia fermento katalitinio aktyvumo kitimą.
Fermentū molekulinių masių reikšmės kinta nuo kelių tūkstančių iki kelių milijonų. Gamtoje randama fermentų, kurių molekulinės masės nėra didelės (iki 50 000). Tačiau dauguma turi didesnes, sudarytas iš subvienetų. Taip katalazė (M - 25 100) turi savyje 6 protomerus (po M - 42 000). Yra daug protomerų komponavimo į multimerus būdų.
Labai svarbu, kad fermentas sudarytas iš subvienetų parodo maksimalų katalitinį aktyvumą būtent kaip multimeras: disociacija i protomerus smarkiai sumažina fermento aktyvumą. Ne visi fermentai-multimerai sudaryti iš katalitiškai aktyvių protomerų. Kartu su katalitiniais, jų sudėtyje rasti reguliuojantys subvienetai, kaip pavyzdžiui aspartatkarbomiltransferazėje.
Fermentai-multimerai tam tikrais atvejais sudaryti iš dviejų tipų subvienetų, sąlyginai pažymimų A ir B. Jie panašūs tarpusavyje, tačiau skiriasi pirminės ir tretinės struktūros detalėmis. Priklausomai nuo A ir B tipo protomerų sąveikos, multimeras gali egzistuoti kelių izomerų pavidalu, kurie vadinami izozimais.
Šiuo metu labai padidėjęs susidomėjimas izozimais. Pasirodė, jog be genetiškai determinuotų izozimų yra didelė fermentų grupė, turinti daugybę formų, susidarančių jų posttransliacinės modifikacijos rezultate.
Daugybinės fermentų formos ir izozimai konkrečiai naudojami diagnozuojant ligas medicinoje, prognozuojant gyvūnų produktyvumą, parenkant tėvų poras kryžminant, tam, kad pasiekti normalios heterozės pas palikuonis.
Erdvinės fermentų organizacijos reikšmė ypač išryškėja tiriant multienzimus, t.y. fermentus, turinčius galimybę tuo pačiu metu pagreitinti kelias chemines reakcija ir vykdyti sudėtingus substrato virsmus.
Kai multienziminis kompleksas aptarnauja vieningą, daugiapakopį biocheminių virsmų procesą, jis vadinamas metabolonu (nuo žodžio metabolizmas - medžiagų apykaita). Tokie yra glikolizės, eilės aminorūgščių biosintezės, eilės dikarbonatinių ir trikarbonatinių rūgščių metabolonai.
Laike ir erdvėje suderintos visų trijų rūšių į jo sudėtį įeinančių fermentų veiklos rezultate, multienzimas didžiuliu greičiu vykdo rūgšties virsmą. Palyginus neseniai išaiškintas dar vienas fermentų sudėties bruožas: kaikurie jų yra pusiaufunkcionalūs, t.y. turi kelis enzimatinius aktyvumus, tačiau tik polipeptidinės grandinės principu.
Fermentų nomenklatūra
Fermentologija labai ilgai netūrėjo griežtai mokslinės fermentų nomenklatūros. Trivialinės nomenklatūros pavyzdžiais galime pavadinti pepsiną (gr. pepsis - viškinimas), tripsiną (gr. tripsis - skystinimas), i.r papainą (nuo melioninio medžio Carica papaja, iš kurio sulčių jis padarytas). Pagal savo veikimo principą šie fermentai vadinami proteolitiniais t.y. jie greitina proteinų hidrolizę.
Charakteringą pavadinimą turi grupė pigmentuotų ląstelės vidaus fermentų, pagreitinančių regeneruojančias reakcijas - citochromai (gr. Labiausiai paplitusi yra racionalioji nomenklatūra, pagal kurią fermento pavadinimas sudaromas iš substrato pavadinimo ir galūnės -azė. Ji buvo pasiūlyta 1883 m. E.Diuklo, pastero mokinio.
Fermentas pagreitinantis krakmolo hidrolizės reakciją buvo pavadintas amilazė (gr. amilon - krakmolas), riebalų hidrolizę - lipazė (gr. Kai analitinės chemijos metodais buvo pasiekti tam tikri rezultatai prostetinių grupių iššifravimo srityje, atsirado nauja fermentų nomenklatūra.
juos ėmė vadinti pagal prostetinės grupės pavadinimą, pavyzdžiui geminfermentas (preostetinė grupė - gem), piridoksal-fermentas (prostetinė grupė - piridoksal). Vėliau fermento pavadinime imta nurodinėti ne tik substrato charakterį, bet ir katalizuojamos reakcijos tipą.
Pavyzdžiuo fermentas atimantis iš gintaro rūgšties molekulės vandenilį, vadinamas sukcinoatdehidrogeneze. 1961 metais Tarptautinė fermentų nomenklatūros komisija, V Tarptautiniame biologijos kongrese, pateikė nomenklatūros, grįstos grižtai moksliniais principais projektą. Projektas buvo patvirtintas kongreso, ir naujoji nomenklatūra įsitvirtino fermentologijoje.
Pagal ją fermento pavadinimas susideda iš cheminio substrato pavadinimo ir fermento vykdomos reakcijos pavadinimo. Pavyzdžiui, piridoksalfermentas, katalizuojantis peraminavimo reakciją tarp L-alanino ir α-ketoglutaro rūgšties, vadinasi L-aninas: 2-oksoglutarato aminotrasnferazė.
Šiame pavadinime pažymėti visi trys požymiai: 1) substratas yra L-alaninas; 2) akceptorius- 2-oksoglutaro rūgštis; 3) aminogrupė persiduoda nuo substrato prie akceptoriaus. Fermentų pavadinimai pagal mokslinę nomenklatūrą yra kur kas tikslesni, bet kartais tampa sudetingesni už senuosius trivialius.
Šiame pavadinime duotas tikslus cheminis substrato pavadinimas ir nurodyta, kad fermentas katalizuoja amidogrupės hidrolizės reakciją. Ryšium su žymių mokslinių pavadinimų sudėtingėjimu naujoje nomenklatūroje leidžiama vartoti ir senus trivialinius pavadinimus.
Tarptautinė komisija sudarė detalų visų tuo metų žinomų fermentų sąrašą, papildytą 1972 metais, peržiūrint kai kurių fermentų nomenklatūrą ir klasifikaciją, kur šalia mokslinio pavadinimo duodams ir senasis, o taip pat nurodomas fermento katalizuojamos reakcijos chemizmas ir kai kuriais atvėjais fermento prigimtis.
Tokiu būdu išvengta nesusipratimų fermentų nomenklatūroje. Kiekvienam fermentui suteiktas individualus numeris (šifras). Pavyzdžiui ureazės šifras - 3.5.1.5. Tai reiškia, kad ureazė yra 3 klasės fermentas, kurie katalizuoja hidrolizės reakcijas.
Antras skaičius - 5 reiškia, kad ureazė priklauso 5 poklasei tos klasės, kuriai priklauso visi fermentai pagreitinantys C-N ne peptidinių ryšių hidrolizę. Aukščiau minėta Laktadehidrogenezė turi 1.1.1.27 tai yra priklauso 1 klasės fermentams (oksidoreduktazės), 1 poklasei (oksioreduktazės, veikiančios CH-OH grupes kaip vandenilio atomų donorai). 1 popoklasei (vandenilio atomų akceptorius yra nikotinamidadedinuk...
Fermentų veiklos reguliavimo būdai
Fermentų veiklos greitis priklauso nuo tam tikrų substratų ir kofaktorių koncentracijos, pH terpės, temperatūros, o taip pat nuo specifinių aktyvatorių ir inhibitorių (pvz. adenilo nukleotidų, karbonilinių, sulfhidrilinių junginių ir kt.) egzistavimo.
Medžiagų apykaitos reakcijų greitis yra reguliuojamas mažėjant arba didėjant alosterinių (reguliacinių) fermentų aktyvumui. Šių fermentų molekulių paviršiuje yra alosteriniai centrai, kuriuose jungiasi specifiniai reguliatoriai, keičiantys fermentų aktyvumą. Specifiniais reguliatoriais būna nukleotidai (AMP, ATP), aminorūgštys ir kiti mažos molekulinės masės junginiai.
Alosterinė reguliacija dažniausiai vyksta grįžtamojo ryšio principu, kai galutinis produktas mažina fermento, katalizuojančio šio proceso pirmąją reakciją, aktyvumą. Baltymų, sudarytų iš subvienetų ir turinčių kelis aktyvius centrus, alosterinė reguliacija vyksta kooperatiniu principu.
Prisijungus vienai substrato molekulei arba alosteriniam efektoriui pasikeičia gretimo subvieneto konformacija ir kita substrato molekulė gali lengviau (teigiamas kooperatinis efektas) arba sunkiau (neigiamas) prisijungti prie baltymo molekulės. Teigiamas kooperatinis efektas būna hemoglobino molekulei prijungiant deguonį.
Magnio įtaka fermentų veiklai
Magnio trūkumas gali labai stipriai atsiliepti lipidų apykaitai ir sugadinti nuotaiką pamačius kraujo cholesterolio tyrimus. Esminis fermentas mūsų organizmui sintetinat cholesterolį yra HMG-CoA reduktazė (HR). Kadangi magnio ar ATP šis procesas negali įvykti, HR nepavyksta išjungti ir ji lieka aktyvi. Daliai fermentų, kurie aktyvina HR taip pat reikalingas Mg, tačiau jį gali pakeisti kiti metalai, pavyzdžiui manganas.
Kitas labai svarbus lipidų apykaitai fermantas, kurį taip pat aktyvina Mg, yra - lecitincholesterolaciltransferazė (LCAT). Šis fermentas esterifikuoja cholesterolį (cholesterolio esterifikacija yra universalus mechanizmas, leidžiantis kaupti ir pernešti didelius cholesterolio kiekius tarp organų ir audinių bei išvengti ląstelinio cholesterolio pertekliaus toksiškumo [4]) ir taip sudaro galimybes daugiau cholesterolio prisijungti prie DTL.
Dar vienas fermentas, susijęs su cholesterolio apykaita, kurio veiklai turi reikšmės Mg yra lipoproteinlipazė (LPL). Lipoproteinlipazė (LPL) vaidina svarbų vaidmenį lipidų apykaitoje. Nors iš pirmo žvilgsnio magnis ir cholesterolis atrodo visiškai nesusiję dalykai, tačiau iš tiesų cholesterolio apykaita labai stipriai priklauso nuo magnio kiekio mūsų organizme.